PCR
In diesem Versuchsteil soll das Gen, welches für das grün-fluoreszierende Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea victoria mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden. Wie der Name schon vermuten lässt, leuchtet bzw. fluoresziert das Protein grün unter UV-Licht. Diese Eigenschaft des Proteins wird sich vielfach in der Molekularbiologie zunutze gemacht, zum Beispiel wird es mit anderen Proteinen gekoppelt, um unter dem Mikroskop deren Lokalisation in lebenden Zellen zu bestimmen.
Das PCR-Programm besteht aus aufeinanderfolgenden Schritten, welche während des Versuchs in das PCR-Gerät eingegeben werden müssen:
Die Denaturierung der DNA wird bei einer Temperatur von 94 °C erreicht (Schritt 1: Initiale Denaturierung für mehrere Minuten)
Schritt 2: kurze Denaturierung von 30 s als Teil eines wiederkehrenden Zyklus).
Bei der Anlagerung der Primer (Schritt 3) wird die Temperatur für 20-30 s gesenkt, dabei liegt die Temperatur in der Regel 5-10 °C unter der Tm der Primer liegen.
Die Dauer der Elongations-Phase (Schritt 4) wird durch die Größe des Gens und die Synthesegeschwindigkeit der DNA-Polymerase bestimmt. So kann die Taq-Polymerase bei einer optimalen Temperatur von 72 °C ca. 1000 Nukleotide/min synthetisieren.
Nach diesem Schritt beginnt ein neuer Zyklus, wobei die Schritte 2-4 einen Zyklus bilden, welcher 30-35 Mal wiederholt wird.
Die finale Elongation (5) dient dazu, dass alle bis dahin erstellten DNA-Fragmente von der DNA-Polymerase vollendet werden, weshalb dieser Schritt zwischen 2 und 5 min dauern sollte.
Bis zur weiteren Verwendung der PCR wird diese bei 4-8 °C in dem PCR-Gerät kühl gehalten.
An die PCR anschließend wird das amplifizierte GFP-Gen mittels Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Dazu werden ein DNA-Marker zur Größenbestimmung sowie die verschiedenen Proben auf ein Agarose-Gel aufgetragen.
